彗星法DNA损伤测试盒说明书

                                               彗星法

一、测定原理：

DNA 在自由基（如·OH）的攻击下容易发生损伤，即脱氧戊糖遭到破环，磷酸二脂键的断裂，碱基的破环或脱落，便可进一步产生单链断裂或双链断裂。将细胞固定于低熔点琼脂糖中，取少量细胞涂在载玻片上，用碱高盐溶液破坏细胞膜，再用碱溶液使 DNA 分子解旋。将载玻片置于电泳液中，在电场的作用下，DNA 分子向阳极移动。如果 DNA 损伤严重， 碎片多，则电泳速度快。未受损伤的 DNA 大分子则由于细胞膜的阻隔，滞留在原处。用 PI 染色或银染，可观察到 DNA 受损的细胞形同彗星现象，作定性分析。也可用相关的软件作定量分析。

二、试剂盒组份：

 彗星法DNA损伤测试盒说明书

三、所需仪器及自备试剂：

低速离心机、水平电泳仪、荧光显微镜、37℃和 45℃恒温水浴箱、载玻片、盖玻片、平皿、微量移液器、1.5ml Microtube、0.4mmol/L Tris-HCl（pH7.5）缓冲液、PBS

四、注意事项：Propidium Iodide（PI）和EB有毒，操作时要戴手套。

五、操作步骤：

1、细胞用冰冷的 PBS 洗一次，离心收集，用 PBS 重悬使其密度为 1×10^6 个/ml；

2、铺胶：下述各浓度琼脂糖凝胶均用 PBS 配制，

第 1 层凝胶的制备：将载玻片的磨砂面向上，45℃预热，将预热 45℃的 100μl 的 0.5%正常熔点琼脂糖（NMA）铺于载玻片上，盖上干净的盖玻片，再置 4℃ 下 10min 使 NMA 凝固。

第 2 层凝胶的制备：将 10μl 细胞（约 104 个）和 75μl 的 0.7%低溶点琼脂糖 LMA（在 37℃ 下水浴加热至少 20min 使之完全溶化）混合均匀。然后，轻轻揭去盖玻片，迅速将含细胞的 LMA 滴到第 1 层琼脂糖上，立即盖上另一干净盖玻片，置 4℃10min 使第 2 层 LMA 凝固。

第 3 层凝胶的制备：第 2 层 LMA 凝固后，在室温下小心移去盖玻片，滴加预热 37℃的75μl 的 0.7%低溶点琼脂糖 LMA，如上盖上盖玻片 4℃下凝固（第三层覆盖第二层周围 0.5mm，增加凝胶化作用时间至 30min，高湿度环境）。

3、细胞裂解：移去盖玻片，将玻片置于平皿中，倒入预冷的 Lysis Bufffer（使用前每 9ml 加入 1ml 的 DMSO），4℃裂解 1～2h，取出载玻片用 PBS 漂洗。

4、DNA 碱解旋：将载玻片置于水平电泳槽。倒入新配制的碱性电泳缓冲液（用户自备 1mmol/L EDTA，300mmol/L NaOH），约覆过载玻片胶面 0.25cm 左右，室温放置 20～ 60min,以便使 DNA 在碱性条件下解螺旋和产生碱易变性区段，使 DNA 断链在电场中易于迁移。

5、单细胞电泳：在电压 25V，电泳 20～30min，电压、电流可用改变缓冲液面高低来调节。

6、中和与染色：电泳后将载玻片置于平皿内。加入 0.4mmol/L Tris-HCl（ph7.5）缓冲液，将载玻片没入，4℃中和三次，每次 10min，弃去 Tris-HCl 缓冲液，每载玻片加 20μl 的 PI 染液或 EB 染液，盖上盖玻片，避光染色 10min。

7、观察、拍照和分析：荧光显微镜 515～560nm 波长的激发光、PI 染色的 DNA 图象呈红色，EB 染色的DNA 图象呈桔红色，可清楚地观察到核DNA 和迁移的DNA（即慧星尾）。每个样本随机选择100 个细胞，测定核DNA 直径和DNA迁移的长度，可并用相应的软件分析。

DNA 损伤按慧星尾部 DNA 量占全部 DNA 量的比例分为 5 级：

0 级：    ＜ 5%           无损伤；

1 级：   5 ～20%          轻度损伤；

2 级：   20～40%          中度损伤；

3 级：   40～95%          高度损伤；

4 级：   ＞ 95%          重度损伤。

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