CRISPR/Cas9系统及其应用
随着CRISPR/Cas9技术的兴起，实现了对动植物基因组编辑的广泛应用。CRISPR/Cas9技术源自Ⅱ型CRISPR/Cas系统，Cas9是一种核酸内切酶，双tracrRNA:crRNA设计成为单向导序列（sgRNA），其5’端的20个核苷酸序列通过碱基互补配对原则与靶位点的DNA结合，3’端与Cas9蛋白结合。sgRNA与DNA靶序列特异性结合，使Cas9能够在特异性位点使靶细胞基因组DNA双链断裂（如图1）。随后，靶细胞通过非同源端连接产生InDels，实现基因敲除；或提供dsDNA供体模板通过同源重组修复的方法实现基因的定点突变或是基因插入。对Cas9蛋白关键活性位点D10A和H840A进行突变后，使Cas9丧失催化活性但不影响其与目标DNA序列结合的能力。这种突变的Cas9蛋白被称为dCas9，可应用于CRISPR激活（CRISPRa：dCas9与单个转录激活因子VP64连接可激活目的基因），亦可用于CRISPR干扰 (CRISPRi：dCas9与转录抑制子KRAB融合后结合到靶基因TSS位点抑制转录起始，沉默靶基因的表达) 。
图1：CRISPR/Cas9系统的工作流程
Jennifer A. Doudna et al., Science. 2014 Nov 28;346(6213):1258096.
CRISPR/Cas9系统操作简单，可针对任何感兴趣的靶基因设计不同的sgRNA，且拥有独特的DNA切割机制、多重靶点识别能力等特点，能够精确、高效地靶向、编辑、修改、调节和标记各种细胞和生物的基因组位点。CRISPR/Cas9系统的诞生，使碱基编辑、转录调控和表观遗传编辑、基因组规模的筛选以及细胞和胚胎治疗等方面得到广泛的发展和应用，CRISPR/Cas9文库的应用也让基础研究中大规模的基因组编辑和筛选成为现实。在筛选功能增益方面CRISPRa比较有效；在筛选缺失功能方面CRISPRi文库较RNAi文库更有效。
慢病毒载体是CRISPR/Cas9系统的主要载体之一，因慢病毒有适用宿主范围广、感染效率高、具有生物安全性、整合基因到宿主细胞实现长期稳定表达的特点，可实现CRISPR/Cas9文库对靶细胞有效且准确的基因编辑。下面就一起来了解慢病毒载体和CRISPR/Cas9相关的基因编辑系统如何应用于基础研究。
案例1——慢病毒＆CRISPR/Cas9文库（全基因组文库）
Elaiophylin triggers paraptosis and preferentially kills ovarian cancer drug-resistant cells by inducing MAPK hyperactivation
作者单位：华中科技大学同济医学院
IF:38.104
精细调节的丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路对癌细胞的存活很重要。经前期化合物库的筛选确定了茶叶素是一种自噬抑制剂。在本研究中证明了茶叶素在多种癌细胞中通过过度激活MAPK通路诱导内质网应激、内质网衍生的细胞质空泡化以及随后的细胞凋亡的作用。CRISPR/Cas9全基因组敲除文库筛选鉴定出MAPK通路中的SHP2是茶叶素诱导细胞凋亡的关键靶点。细胞热位移实验(CETSA)和表面等离子体共振(SPR)实验进一步证实了SHP2与茶叶素直接结合。通过SHP2敲低或药理抑制SHP2/SOS1/MAPK通路明显减弱了茶叶素诱导的细胞凋亡和自噬抑制。茶叶素通过触发细胞凋亡来克服耐药性，这提示茶叶素可能为难治性卵巢癌提供一种合理的治疗策略。
图2：全基因组CRISPR/Cas9敲除文库筛流程及茶叶素诱导自噬抑制示意图。
Guan-Nan Li et al., Signal Transduction and Targeted Therapy. 2022 Sep 12;7(1):317.
★文库来源：购买自Addgene (#1000000049)
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案例2——慢病毒＆CRISPR/Cas9文库（激活文库）
Genome-wide CRISPR screen identifies MTA3 as an inducer of gemcitabine resistance in pancreatic ductal adenocarci
作者单位：天津医科大学肿瘤医院
IF:9.756
临床胰腺导管腺癌(PDAC)治疗失败的主要原因之一是产生吉西他滨(GEM)耐药。作者通过CRISPR/Cas9激活文库筛选发现MTA3介导了PDAC的GEM耐药，因此MTA3可能成为潜在联合化疗的治疗靶点。CRISPR文库筛选显示MTA3是GEM处理后存活细胞中富集最多的基因，生物信息学和组织学分析提示其与GEM耐药高度相关。体内外实验均证实MTA3可促进胰腺癌细胞对GEM的耐药。机制上，MTA3作为Mi-2/核小体重塑和去乙酰化酶转录抑制复合物的组成部分，抑制NF-κB/p65的转录抑制因子CRIP2的转录，激活NF-κB信号通路，从而导致GEM耐药。此外，GEM可通过激活STAT3信号通路上调PDAC细胞中MTA3的表达，从而诱导PDAC对GEM产生获得性耐药。MTA3在胰腺癌GEM耐药中起关键作用，有望成为逆转GEM耐药的治疗靶点。
图3：利用CRISPR激活文库筛选MTA3作为潜在的GEM耐药相关基因。
Liangliang Wu et al., Cancer Lett. 2022 Aug 15;548:215864.
★文库来源：人类CRISPR激活文库购买自Addgene(#1000000078)
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案例3——慢病毒＆CRISPR/Cas9文库（lncRNA激活文库）
Lnc-DC promotes estrogen independent growth and tamoxifen resistance in breast cancer
作者单位：杭州医学院附属人民医院
IF:9.685
选择性雌激素受体调节剂(SERMs)—他莫昔芬已被证明在雌激素受体(ER)阳性乳腺癌的治疗中是有效的。然而，这种内分泌治疗的主要障碍是雌激素非依赖性生长导致的耐药，其潜在机制尚不完全清楚。本研究探讨了长链非编码RNA (lncRNAs)是否参与调控ER阳性乳腺癌的雌激素非依赖性生长和他莫昔芬耐药。研究基于CRISPR/Cas9的SAM(协同激活介质)文库确定了候选Lnc-DC。通过分析表明，Lnc-DC能够通过上调抗凋亡基因Bcl2和Bcl-xL来减少他莫昔芬诱导的细胞凋亡。此外，Lnc-DC通过磷酸化(pSTAT3Y705)激活STAT3，随后诱导细胞因子的表达而激活STAT3，形成自分泌环路。临床上，Lnc-DC高表达与患者不良预后相关，本研究证明Lnc-DC/STAT3/细胞因子轴在雌激素非依赖性生长导致他莫昔芬耐药中的功能，Lnc-DC可能是他莫昔芬应答的潜在预测因子。
图4：鉴定Lnc-DC参与雌激素非依赖性和他莫昔芬耐药。
Wan-Xin Peng et al., Cell Death and Disease. 2021 Oct 25;12(11):1000.
★文库来源：双载体SAM文库，购买自Addgene(#61426、#61425)
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案例4——慢病毒＆CRISPR/Cas9文库（定制文库）
Targeting euchromatic histone lysine methyltransferases sensitizes colorectal cancer to histone deacetylase inhibitors
作者单位：德国癌症研究中心(DKFZ)
IF:7.316
结直肠癌(CRC)一个重要的特征是表观遗传失调。针对晚期癌症，表观遗传药物与抗肿瘤药物结合是一种有前景的治疗策略。作者利用合成致死的概念来识别与组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂协同作用以降低CRC生长的表观遗传靶点。研究使用针对614个表观遗传调节因子定制sgRNA文库进行CRISPR/Cas9筛选，发现敲除常染色质组蛋白赖氨酸N-甲基转移酶1和2 (EHMT1/2)显著增强了临床使用的HDAC抑制剂的抗增殖作用。通过对1066例不同肿瘤分期的结直肠癌样本进行组织芯片分析，发现EHMT2蛋白在晚期结直肠癌低表达，且与不良临床结局相关。机制上，协同抑制HDAC和EHMT1/2可引起减少肿瘤细胞生长的不同机制，包括细胞周期阻滞和自噬的调节。表观遗传水平上，这些化合物增加H3K9乙酰化，降低H3K9二甲基化。功能表型上，协同抑制HDAC和EHMT1/2可降低患者来源的CRC类器官肿瘤的活力。
图5：聚焦CRISPR/Cas9筛选确定EHMT1和EHMT2敲除对HDAC抑制剂的增敏作用。
Leonhard Valentin Bamberg et al., Int. J. Cancer. 2022;151:1586–1601.
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