抗体的制备方法与原理

一、抗血清的制备

　　有了质量好的抗原，还必须选择适当的免疫途径，才能产生质量好（特异性强和效价高）的抗体。

　　（一）用于免疫的动物

　　作免疫用的动物有哺乳类和禽类，主要为羊、马、家兔、猴、猪、豚鼠、鸡等，实验室常用者为家兔、山羊和豚鼠等。动物种类的选择主要根据抗原的生物学特性和所要获得抗血清数量，如一般制备抗r-免疫球蛋白抗血清，多用家兔和山羊，因动物反应良好，而且能够提供足够数量的血清，用于免疫的动物应适龄，健壮，无感染性疾患，最好为///雄性，此外还需十分注意动物的饲养，以消除动物的个体差异以及在免疫过程中死亡的影响。若用兔，最好用纯种新西兰兔，一组三只，兔的体重以2～3kg为宜。

　　（二）免疫途径

　　免疫途径有多种多样，如静脉内、腹腔内、肌肉内、皮内、皮下、淋巴结内注射等，一般常用皮下或背部多点皮内注射，每点注射0.1ml左右。途径的选择决定于抗原的生物学特性和理化特性，如激素、酶、毒素等生物学活性抗原，一般不宜采用静脉注射。

　　（三）佐剂

　　由于不同个体对同一抗原的反应性不同，而且不同抗原产生免疫反应的能力也有强有弱，因此常常在注射抗原的同时，加入能增强抗原的抗原性物质，以刺激机体产生较强的免疫反应，这种物质称为免疫佐剂。

　　佐剂除了延长抗原在体内的存留时间，增加抗原刺激作用外，更主要的是，它能刺激网状内皮系统，使参与免疫反应的免疫活性细胞增多，促进T细胞与B细胞的相互作用，从而增强机体对抗原的细胞免疫和抗体的产生。

　　常用的佐剂是福氏佐剂（Freund adjuvant）,其成分通常是羊毛脂1份、石腊油5份，羊毛脂与石腊油的比例，视需要可调整为1：2～9（V/V），这是不完全福氏佐剂，在每毫升不完全佐剂加入1～20mg卡介苗就成为完全佐剂。

　　配制方法：按比例将羊毛脂与石蜡油置容器内，用超声波使之混匀，高压灭菌，置4℃下保存备用。免疫前取等容积完全或不完全佐剂与免疫原溶液混合，用振荡器混匀成乳状，也可以在免疫前取需要量佐剂置乳钵中研磨，均匀后再边磨边滴加入等容积抗原液（其中加卡介苗3～4mg/ml或不加），加完后再继续研磨成乳剂，滴于冰水上5～10min内完全不扩散为止。为避免损失抗原，亦可用一注射器装抗原液，另一注射器装佐剂，二者以聚乙烯塑料管连接，然后二者来回反复抽吸，约数十分钟后即能完全乳化。检查合格后即以其中一注射器作注射用。

　　（四）免疫方法

　　抗原剂量，首次剂量为300～500μg，加强免疫的剂量约为首次剂量为1/4左右。每2～3周加强免疫一次。加强免疫时用不完全佐剂，首次免疫时皮下注射百日*疫苗0.5ml，加强免疫时不必注射百日*疫苗。

　　在第2次加强免疫后2周，从耳缘静脉取2～3ml血，制备血清，检测抗体效价（见后）。如未达到预期效价，需再进行加强免疫，直到满意时为止（图2-3）。当抗体效价达到预期水平时，即可放血制备抗血清。

图2-3 抗体反应

　　（五）抗血清的采集与保存

　　家兔是最常用以产生抗体的动物，因此这里主要讨论兔血的收集。羊等较大动物以颈静脉、动脉取血，鼠等小动物取血可参阅有关资料。取兔血有两种方法，一是耳缘静脉或耳动脉放血，一是颈动脉入血，也可心脏采血。取动脉或静脉放血时，将兔放入一个特造的木匣或笼内，耳露于箱（笼）外，也可由另一人捉住兔身。剪去耳缘的毛，用少许二甲苯涂抹耳廓，30s后，耳血管扩张、充血。用手轻拉耳尖，以单面剃须刀或尖的手术刀片，快速切开动脉或静脉，血液即流出，每次可收集30～40ml 。然后用棉球压迫止血，凝血后洗去二甲苯。二星期后，可在另一耳放血。此法可反复多次放血。颈动脉放血时，将兔仰卧，固定于兔台，剪去颈部的毛，切开皮肤，暴露颈动脉，插管，放血。放血过程中要严格按无菌要求进行。

　　收集的血液置于室温下1h左右，凝固后，置4℃下，过夜（切勿冰冻）析出血清，离心，4000rpm,10min。在无菌条件，吸出血清，分装（0.05～0.2ml），贮于-40℃以下冰箱，或冻干后贮存于4。C冰箱保存。

　　（六）抗血清质量的评价

　　在免疫期间，不仅各个不同的动物，而且同一动物在不同的时间内抗血清效价、特异性、亲合力等都可能发生变化，因而必须经常地采血测试。只有在对抗血清的效价、特异性、亲合力等方面作彻底的评价后，才可使用所取得的抗血清。

　　1．效价 　抗血清的效价，就是指血清中所含抗体的浓度或含量。效价测定的方法常用的是放射免疫法，此法对所有的抗体均适用。某些由大分子（如蛋白类）抗原所产生的抗体，可用双扩散等方法测定。前者测定的效价极为精确。而后者则粗糙得多。

　　（1）放射免疫法： 以不同稀释度的抗血清与优质标记抗原混合，孵育24h后，测定其结合率。通常以结合率为50%的血清稀度和为效价。如某抗血清的结合率为50%时的稀释度为1：15000，则该血清的效价就是1：15000。抗血清的效价，除由抗血清本身的性质决定外，还受标记抗原的质量、孵育时间，所用稀释液的成分及其pH等因素的影响，在工作中必须引起注意。（测定方法见第8章　）

　　（2）双向扩散法：利用大分子抗原和抗体在琼脂平板上扩散，两者在相交处产生沉淀线，以观察和判断抗血清中是否有抗体及其浓度。

　　球脂板的制备：100ml pH7.1 的磷酸盐缓冲液加到15g的琼脂内，于水浴中加温，搅拌，使琼脂完全溶解，趁热用纱布过滤，待溶液冷却到65℃左右时，加入叠氮钠（NaN3），使其在溶液中的浓度为0.1%。用移液管把琼脂放在干净平皿或玻片上，约3mm厚，待其冷却，完全凝固后，用打孔器打孔（图2-4）。中央孔内加适量抗原（容量为50μl），周围各孔内分别加入50μl 1：2、1：4、1：8、1：16、1：32及不稀释的抗血清，37℃下孵育24h，观察有无沉淀线产生，以判断血清的稀释度（图2-5）。

图2-4 双向扩散模型

图2-5 免疫扩散试验

　　2．特异性测定 　　抗血清的特异性或称专一性是指抗血清对相应的抗原及近似的抗原物质的识别能力。特异性好就是抗血清的识别能力强。通常，特异性是以交叉反应率来表示的。交叉反应率低，表示抗血清的特异性好，反之则特异性差。交叉反应率一般是用竞争抑制曲线来判断的。以不同浓度的抗原和近似抗原物质分别做竞争抑制曲线，计算各自的结合率（B/T或B/B0），求出各自在IC50时的浓度，按下列公式计算交叉反应率。

　　S=y/Z×100%

　　S：交叉反应率，y：IC50时抗原浓度，Z：IC50时近似抗原物质的浓度。

　　如某抗原的IC50浓度为90Pg/管，而一些近似抗原物质IC50浓度几乎是无限大，可以说这一抗血清与其它抗原物质的交叉反应率近似零，即无交叉反应，该抗血清的特异性是好的。

　　3．亲合力 　　在免疫学中， 亲合力是指抗体与结合抗原体的活度或牢固度。抗体与抗原结合疏松，结合后会迅速解离，称为亲合力低，反之，亲合力高。亲合力的高低是由抗原分子的大小，抗体分子的结合位点与抗原的决定基之间的立体结构型的合适程度决定的。亲合力常以亲合常数K表示。K的单位是升/摩尔（L/mol）。在RIA中，K是该抗血清能达到的最小检出量（灵敏度）的倒数，K=1/[H]，[H]是最小检出量，通常，K的范围在108～1012L/mol之间，也有高达1014L/mol的。

　　计算亲合常数的方法20余种，计算出的K都不能真实反映实验情况，只能作为参考。

　　（七）免疫失败的可能原因及应采取的措施

　　有时不能获得满意的抗血清，可从下列几方面找原因，并改进之。

　　（1）免疫动物的种属及品系是否合适，可考虑改变动物的种属或品系，或扩大免疫动物的数量。

　　（2）抗原质量是否良好，可改用其它厂家的产品或改用同一厂家的其它批号，也可考虑改变抗原分子的部分结构，或改进提取方法。

　　（3）制备的免疫原是否符合要求，可从偶联剂，载体、抗原或载体的比例、反应时间等多方面去考虑，并加以改进。

　　（4）所用的佐剂是否合适，乳化是否完全，可改用其它佐剂，或加强乳化。

　　（5）免疫的方法、剂量，加强免疫的间隔时间和次数，免疫的途径是否合适。

　　（6）动物的饲养是否得当，如营养（饲料、饮水）、环境卫生（通风、采光、温度）是否符合要求，动物的健康情况是否良好等。

　　二、单克隆抗体的制备

　　1975年Kohler和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞与和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合，形成的杂交瘤细胞既可产生抗体，又可无性繁殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。这一技术上的突破使血清学的研究进入了一个高度精确的新纪元。

　　免疫细胞化学的 技术关键之一是制备特异性强、亲合力大、滴度高的特异性抗体，由于每种抗原都有几个抗原决定簇，用它免疫动物将产生对各个决定簇的抗体，即多克隆抗体。单克隆抗体则是由一个产生抗体的细胞与一个骨髓瘤细胞融合而形成的杂交廇细胞经无性繁殖而来的细胞群所产生的，所以它的免疫球蛋白属同一类型，质地纯一，而且它是针对某一抗原决定簇的，因此特异性强，亲合性也一致。单克隆抗体（McAb）的特性和常规血清抗体的特性比较见2-3。

表2—3 单克隆抗体（McAb）和常规免疫血清抗体的特性比较

　　单克隆抗体的制备方法如下。

　　（一）动物的选择与免疫

　　1．动物的选择 　纯种BALB/C小鼠，较温顺，离窝的活动范围小，体弱，食量及排污较小，一般环境洁净的实验室均能饲养成活。目前开展杂交瘤技术的实验室多选用纯种BALA/C小鼠。

　　2．免疫方案 　　选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb至关重要。一般在融合前两个月左右根据确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性不同而定。

　　（1）可溶性抗原免疫原性较弱，一般要加佐剂，半抗原应先制备免疫原，再加佐剂。常用佐剂：福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂。

　　初次免疫 抗原1～50μg加福氏完全佐剂皮下多点注射或脾内注射（一般0.8